發(fā)布時(shí)間： 2025-12-23 點(diǎn)擊次數(shù)： 37次
測(cè)序酶是基因測(cè)序、文庫(kù)構(gòu)建及分子診斷的核心工具，其活性與特異性直接影響數(shù)據(jù)質(zhì)量與實(shí)驗(yàn)成敗。在實(shí)際操作中，常因保存不當(dāng)、反應(yīng)體系失衡或模板質(zhì)量問題導(dǎo)致擴(kuò)增失敗、偏好性偏差或背景噪音升高?？茖W(xué)識(shí)別
測(cè)序酶問題根源并采取針對(duì)性措施，是保障測(cè)序結(jié)果可靠性的關(guān)鍵。
一、擴(kuò)增效率低或無產(chǎn)物
原因：酶失活、模板降解、引物設(shè)計(jì)不佳或Mg濃度不足。
解決方法：
確認(rèn)酶活性：避免反復(fù)凍融，使用前短暫離心，按說明書要求在–20℃或–80℃保存；
檢測(cè)模板質(zhì)量：用Nanodrop或Bioanalyzer驗(yàn)證DNA/RNA完整性（A260/A280≈1.8–2.0，RIN＞7）；
優(yōu)化引物Tm值與特異性，避免二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；
進(jìn)行梯度PCR，調(diào)整Mg（通常1.5–3.0mM）或dNTP濃度。
二、非特異性條帶或引物二聚體
多因退火溫度過低或酶用量過多：
提高退火溫度（建議比Tm低3–5℃起步），采用熱啟動(dòng)型聚合酶抑制低溫非特異擴(kuò)增；
減少酶量（如從1U降至0.5U/50μL），避免過度延伸；
添加DMSO（3%–5%）或甜菜堿（1M）改善高GC模板擴(kuò)增特異性。
三、測(cè)序文庫(kù)產(chǎn)量低或片段分布異常
常見于NGS建庫(kù)環(huán)節(jié)：
末端修復(fù)/加A尾不全：確保各步酶反應(yīng)時(shí)間充足（通常20–30分鐘），使用新鮮ATP；
接頭連接效率低：控制插入片段與接頭摩爾比（通常3:1–6:1），避免接頭自連；
純化損失過大：選用高回收率磁珠（如SPRIselect），嚴(yán)格控制乙醇洗滌次數(shù)與晾干時(shí)間。
四、逆轉(zhuǎn)錄失敗（cDNA產(chǎn)量低）
使用無RNase耗材，RNA提取后立即反轉(zhuǎn)錄；
對(duì)長(zhǎng)鏈或二級(jí)結(jié)構(gòu)豐富的RNA，選用含RNaseH突變的高性能逆轉(zhuǎn)錄酶（如SuperScriptIV）；
添加隨機(jī)六聚體+Oligo(dT)混合引物，提升覆蓋均勻性。
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